染色质免疫千里淀测序（ChIP-seq）结合两种广大的技能【TCD-023】射精する極上ペニクリ嬢 上原のぞみ，来研讨卵白质与DNA之间的互相作用。它具有机灵度高和覆盖度高档特色，主要应用于转录因子结合位点、组卵白修饰、基因组甲基化以及核小体定位等研讨。

顾名想义，总共这个词操作分为两部分。开始是通过染色质免疫千里淀技能（ChIP）特异性地富集与主义卵白结合的DNA片断，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集到的DNA片断进行高通量测序（seq）。尽管ChIP-seq在连年来已平庸使用，但并不齐全，还存在如此这般的问题。底下，咱们就来望望ChIP-seq技能是奈何一步步演化的。

传统ChIP-seq

咱们先来了解一下传统ChIP-seq的职责旨趣。开始，应用甲醛固定细胞（甲醛让DNA与卵白质交联），再通过超声或酶解消化将染色质片断化。接着，让特异性的抗体与您感兴致的DNA结合卵白相结合，不竭是转录因子。与抗体结合的染色质片断被免疫千里淀，然后将DNA片断纯化并构建成文库，用于后续的高通量测序。

应用ChIP-seq，研讨东谈主员好像研讨健康和疾病情景下的基因抒发谱，从而有可能发现生物象征物。这是一种无偏向的检测技能，好像完整流露ChIP富集DNA包含的信息。与ChIP-chip比拟，ChIP-seq的上风在于广大的洞开性，寻找未知信息的才气。虽然，这种技能也存在一些劣势。

甲醛固定即是饱受诟病的地点。甲醛措置可能会导致卵白质的交联或抗原表位的袒护。在卵白质交联后，您可能会拿获到不关联的染色质片断，产生误导性的数据。而表位袒护会遮挡免疫千里淀历程中抗原与抗体的结合。于是，自然ChIP-seq（Native ChIP-seq）应时而生。

自然ChIP-seq

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自然ChIP-seq撤废了甲醛固定的顺次，而是应用微球菌核酸酶（MNase）的切割脾气来进行染色质消化。微球菌核酸酶不错快速谦敬地将染色质DNA堵截【TCD-023】射精する極上ペニクリ嬢 上原のぞみ，并最大规定地保留细胞原有的染色质结构以及主义卵白与DNA的结合情景，从而大大提升ChIP的后简直实度。

不外，败落了交联的门径，意味着独一与染色质细致结合的卵白质能被免疫千里淀，如组卵白。在染色质消化和免疫千里淀时辰，卵白结合丢失可能会使数据出现偏差。因此，自然ChIP-seq可能会濒临遑急信息的丢失。同期，它的另一个局限是从总共这个词基因组中采样。超声措置或酶解消化导致细胞核被龙套，总共这个词基因组溶化，这意味着需要深度测序才能永诀主义和配景。

ChEC & ChIC

之后，东谈主们又开发出染色质内源切割（ChEC）和染色质免疫切割（ChIC）这两种技能，不再需要用到超声措置或酶解消化。两种顺次齐将无活性的微球菌核酸酶（MNase）系在感兴致的染色质卵白上，一朝激活，MNase裂解DNA，然后将其提真金不怕火并测序。

尽管这些技能代表了ChIP-seq的遑急超越，但ChEC的迂回在于在体内抒发染色质-MN交融卵白，这意味着必须阐发每种待研讨的染色质卵白构建不同的重组体。ChIC则应用抗体将感兴致的卵白与Protein A-MN相结合来进行DNA切割，从而幸免了构建重组体，但有些ChIC决策引入了甲醛固定操作，又重新回到了领先的问题。

近期大热的CUT&RUN

这两年最火红的技能应该是CUT&RUN，全称为cleavage under targets and release using nuclease，由好意思国Fred Hutchinson癌症研讨中心的Steven Henikoff团队开发。从2017年问世于今，当今已有多篇高影响因子的著作发表。

这项技能的主要特色是，它不错在完整的细胞或细胞核上进行，无需甲醛固定或超声措置。细胞经过透化措置（扩孔）后与主义抗体孵育，抗体插足核内与主义卵白结合；细胞再与卵白A/G联结的MNase孵育，主义抗体Fc段结合Protein A-MNase或Protein A/G-MNase。然后激活MNase酶切割结合位点双方的染色质，这些经过切割的片断扩散到细胞核外，而未切割的部分留在核内，可大大镌汰配景。之后从上清液中收罗DNA片断并测序。

CUT&RUN技能的涌现图（图片来自Henikoff实践室）

详备的操作决策已发表在《Nature Protocols》杂志上1。与传统的ChIP-seq比拟，它幸免了交联的问题；而与自然的ChIP-seq比拟，它又大大镌汰了配景。CUT&RUN的另一个刚正是，下流测序中只是包含关联的染色质复合物，因此它好像镌汰测序读数，从而加速实践程度。

与传统的ChIP-seq比拟，CUT&RUN技能所需的样本更少，妥当研讨温雅的细胞群体。仅需100个细胞，它就能分析特定的组卵白修饰。昨年，匹兹堡大学和马萨诸塞大学医学院的研讨东谈主员对CUT&RUN进行矫正，将样本量降至单细胞水平，并应用于胚胎植入前的胚胎2。更新的CUT&TagHenikoff实践室昨年在Nature Communications还推出了更新的CUT&Taq技能。前边所述CUT&RUN实践赢得的DNA片断纯化后需要建库测序，CUT&Taq跟CUT&RUN比拟，即是用Tn5代替MNase，切割染色质同期加上建库引物照拂——具体来说即是用ProteinA/G-Tn5转座复合物孵育抗体措置过的细胞，Tn5在激活后剪切结合位点双方序列同期能加上测序照拂，剪切居品扩散出细胞核外后回收纯化测序。切割同期加照拂这一步不错简化后继的建库门径，以更快速率赢得更高信噪比。

这两种新技能齐是应用ProteinA/G与抗体的特异亲和性，借助特异性抗体将核酸酶固定靶序列隔邻，限制其切割界限，从而取代了畴昔的交联响应；此外回收扩散出细胞外的切割居品，可大大减少无关的核酸配景，提升信噪比同期更减少测序深度的条目。   （生物通 薄荷）

参考文件

1. Skene， P.， Henikoff， J. & Henikoff， S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc 13， 1006–1019 (2018). https://doi.org/10.1038/nprot.2018.015

2. Hainer【TCD-023】射精する極上ペニクリ嬢 上原のぞみ， S.， Bošković， A. et al. Profiling of Pluripotency Factors in Single Cells and Early Embryos. Cell. 2019 May 16;177(5): 1319-1329.e11. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.014.